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| 導(dǎo)讀 | 盡管源自化膿鏈球菌（SpCas9）的個(gè)且常用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有顯著的特異性，但除了理想的基因剪切和復(fù)制之外，已觀察到不同程度的脫靶效應(yīng)（OTE）。這未免讓研究者感到無所適從，由此，如何避免脫靶效應(yīng)成為了一個(gè)重要議題。 |
距離作為基因組編輯工具僅僅5年，CRISPR幾乎就成為了*的技術(shù)。從一開始作為細(xì)菌切除入侵病毒DNA的方式，到現(xiàn)在，CRISPR已經(jīng)引發(fā)了關(guān)于動(dòng)物模型、高通量篩選、轉(zhuǎn)基因生物和基因治療的一系列討論。
所有的一切都在以令人震撼的速度增長。誠然，CRISPR并非*，但它的優(yōu)點(diǎn)太多，涉及到其可編程并適用于無數(shù)生物、細(xì)胞類型和眾多研究。截止2018年，已經(jīng)發(fā)布了超過2500篇CRISPR的論文。可以說CRISPR充滿無限的可能，這也許就是它具有讓人難以抵抗的魅力所在。
基于此，越來越多的科研人員需要操作CRISPR實(shí)驗(yàn)。然而，盡管源自化膿鏈球菌（SpCas9）的個(gè)且常用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有顯著的特異性，但除了理想的基因剪切和復(fù)制之外，已觀察到不同程度的脫靶效應(yīng)（OTE）。
這未免讓研究者感到無所適從，由此，如何避免脫靶效應(yīng)成為了一個(gè)重要議題，以下是一些CRISPR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的策略，助你實(shí)現(xiàn)脫靶效應(yīng)小化。
選擇合適的靶基因和宿主細(xì)胞
在規(guī)劃基因組編輯實(shí)驗(yàn)時(shí)，要問的個(gè)也許是基本的問題是目的基因是否適合預(yù)期的基因編輯操作（即刪除、插入或突變）以及特定的細(xì)胞環(huán)境（細(xì)胞類型和細(xì)胞系等）。
丨靶基因的選擇
首先，確定目標(biāo)目的基因是否在宿主細(xì)胞中表達(dá)以及它是否對(duì)細(xì)胞活力是必需的。雖然已經(jīng)確定了一組“細(xì)胞必需基因”，但有些基因依賴于背景，因此目的基因在特定細(xì)胞系中的必需性可能仍需要進(jìn)一步確定。
其中一個(gè)方法是根據(jù)siRNA敲低實(shí)驗(yàn)的信息，但在某些情況下，細(xì)胞可能會(huì)在必需蛋白質(zhì)水平降低的情況下也能存活；此外，小鼠基因敲除（KO）數(shù)據(jù)的表型讀數(shù)的也可以檢查目的基因的必需性。
然而，通常很難區(qū)分生物體發(fā)育和細(xì)胞存活本身所需基因，一個(gè)物種中基因的必需性可能也無法轉(zhuǎn)化為另一個(gè)物種的必需性。一些免費(fèi)的在線工具應(yīng)運(yùn)而生，有助于研究者進(jìn)行相關(guān)的分析。
例如，來自華中科技大學(xué)、第四軍醫(yī)大學(xué)和同濟(jì)大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員建立了一個(gè)在線分析細(xì)胞重要性的OGEE™數(shù)據(jù)庫。
OGEE™分析界面截圖（圖片來源：Nucleic Acids Research）
丨細(xì)胞的選擇
對(duì)細(xì)胞（原代細(xì)胞、hPSC、iPSC或細(xì)胞系）信息的了解將有助于確定特定研究的適當(dāng)實(shí)驗(yàn)策略，例如具體操作細(xì)胞與研究疾病的生理相關(guān)性（組織起源和/或分化狀態(tài)）。
對(duì)于某些多核的細(xì)胞類型如骨骼肌細(xì)胞和破骨細(xì)胞，和攜帶染色體異常（包括缺失，重復(fù)或易位）的許多癌細(xì)胞、hPSCs / hESCs /iPSC以及永生化細(xì)胞系，使所有等位基因?qū)崿F(xiàn)有效突變?cè)诩夹g(shù)上具有一定的挑戰(zhàn)性。
另外，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法時(shí)，細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性是需要考慮的重要因素。由于自發(fā)突變和其他基因組影響，特定細(xì)胞系的基因組序列不一定與給定基因的公開參考序列相同。因此，應(yīng)當(dāng)跨越目的基因區(qū)域進(jìn)行測(cè)序以鑒定可能具有干擾gRNA結(jié)合或CRISPR結(jié)果的序列偏差。
鑒于DNA損傷修復(fù)的缺陷是許多形式的人類癌癥的基礎(chǔ)，源自此類癌癥患者的細(xì)胞系將積累更多突變并具有更低的基因組穩(wěn)定性。例如，長期以來報(bào)道來源于患有惡性人淋巴細(xì)胞個(gè)體的細(xì)胞系具有比來自正常個(gè)體的細(xì)胞系更高的突變頻率；與來自健康供體的細(xì)胞相比，來自患有范可尼貧血和共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張的患者的B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系的突變率分別為30倍和4倍，已知這兩種疾病都是由涉及DNA損傷修復(fù)的基因突變引起的。
選擇合適的宿主細(xì)胞系時(shí)要考慮的另一個(gè)重要方面是它的細(xì)胞克隆。雖然許多細(xì)胞系初來源于純種群（即克隆細(xì)胞），但自發(fā)突變以及表觀遺傳變化可能隨著培養(yǎng)過程的細(xì)胞傳代而積累。因此，較低的傳代細(xì)胞總是優(yōu)于培養(yǎng)較長時(shí)間的細(xì)胞。
根據(jù)GSK研發(fā)人員的經(jīng)驗(yàn)，陣列比較基因組雜交（aCGH）加上SNP基因組分析是一種簡單快捷的確定細(xì)胞是否適合用作研究對(duì)象的方法。aCGH檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變，而SNP分析允許檢測(cè)多倍性、雜合性缺失等。當(dāng)組合時(shí)，這些技術(shù)提供關(guān)于細(xì)胞系同源性和染色體重復(fù)/缺失的信息，因此提供關(guān)于位于特定區(qū)段基因的等位基因拷貝數(shù)的信息。此外，還可以對(duì)研究中的細(xì)胞系進(jìn)行其他類型的分析，例如STR、FISH和核型分析。
小化CRISPR脫靶效應(yīng)的策略
丨適當(dāng)?shù)膅RNA設(shè)計(jì)
正確選擇用于將Cas9核酸酶導(dǎo)向靶基因的指導(dǎo)RNA（gRNA）是在CRISPR基因組編輯中減少OTE的基本步驟之一。
有許多不同的軟件工具可用于gRNA的設(shè)計(jì)，原先大多數(shù)程序基于靶DNA選擇性對(duì)gRNA進(jìn)行排序以對(duì)CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)，但許多較新的程序還包括考慮其他因素的算法，例如目標(biāo)切割效率、PAM序列等。
目前，可用的gRNA設(shè)計(jì)工具包括但不限于：
DeepCrispr
Elevation
Benchling
CRISPRscan
CHOPCHOP
GuideScan
gRNA設(shè)計(jì)在線
此外，還有支持CRSIPRi/CRISPRa gRNA設(shè)計(jì)的軟件程序
對(duì)于研究者，這么多工具可供選擇的同時(shí)，可能也會(huì)造成選擇困難。但通過2種或3種不同的工具，然后選擇在每種工具中得分始終較高的gRNA可能是有益的。還有一種選擇是，Addgene公司開發(fā)的CRISPR Software Matchmaker，它可幫助科學(xué)家選擇適合其項(xiàng)目需求的軟件
（圖片來源：Addgene）
丨核酸酶的選擇
核酸酶Cas9能影響切割靶基因的效率和度，是限制CRISPR發(fā)揮巨大潛力的主要問題之一，為此科學(xué)家設(shè)計(jì)出了SpCas9的一系列變體。
值得注意是SpCas9-HF1、eSpCas9（1.1）和隨后設(shè)計(jì)的超變體HypaCas9。這些高保真的SpCas9核酸酶變體，尤其是HypaCas9，在研究中表現(xiàn)出來顯著減少的OTE，同時(shí)保持與原始版本SpCas9相當(dāng)?shù)木庉嬓省ｎ愃频兀硪环NSpCas9變體“Alt-R S.p. HiFi Cas9”，源自易錯(cuò)PCR誘變的功能篩選，據(jù)稱具有顯著降低的OTE，同時(shí)保持了目標(biāo)效率。
此外，科學(xué)家還通過其它策略實(shí)現(xiàn)了OTE的降低，包括使用配對(duì)的gRNA將切口酶Cas9或dCas9-FokI融合蛋白引導(dǎo)至靶向位點(diǎn)。每種方法都依賴于通過一對(duì)gRNA識(shí)別兩個(gè)位置緊密的序列以切割兩條DNA鏈，因此在非靶位點(diǎn)編輯的可能性要低得多。
為了突破PAM序列的限制，其它研究人員使用分子進(jìn)化設(shè)計(jì)了一系列的SpCas9的工程化變體，包括xCas9、SaCas9、KKH saCas9等。據(jù)報(bào)道，這些工程化變體除了具有增加的靶點(diǎn)選擇范圍外，還保持高靶向效率和特異性。
核酸酶的選擇（圖片來源：Journal of Biotechnology）
丨限制核酸酶的暴露時(shí)間
CRISPR核酸酶在宿主細(xì)胞內(nèi)保持活性的時(shí)間長短是導(dǎo)致OTE的另一個(gè)重要因素。Cas9和gRNA的不同表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間具體取決于所用的遞送方法。
在許多情況下，穩(wěn)定且組成型表達(dá)Cas9的細(xì)胞系已用于CRISPR實(shí)驗(yàn)，雖然Cas9的這種強(qiáng)烈和持續(xù)的表達(dá)提高了靶基因編輯的效率，但是可能同時(shí)增加了OTE，因?yàn)镃as9核酸酶的持續(xù)和高水平表達(dá)促進(jìn)了gRNA和靶標(biāo)錯(cuò)配的耐受性。
當(dāng)慢病毒（LV）用于產(chǎn)生表達(dá)Cas9的穩(wěn)定細(xì)胞系時(shí)，使用較高感染復(fù)數(shù)（MOI）將導(dǎo)致更高水平的Cas9表達(dá)，但同時(shí)也導(dǎo)致更高水平的不期望的病毒整合事件。為了減輕這種影響，Ortinski及其同事設(shè)計(jì)了一種用于遞送Cas9和gRNA基因的整合酶缺陷型慢病毒載體，這促使OTE水平顯著降低，同時(shí)保持了相當(dāng)?shù)倪f送和靶向編輯效率。
除此之外，許多其他方法也可以減少Cas9暴露的持續(xù)時(shí)間或水平。例如：使用細(xì)胞滲透性化合物激活的Cas9融合體，從而通過添加細(xì)胞滲透性化合物來穩(wěn)定CRISPR基因組編輯并且減少OTE；Cas9活性也可以通過使用其天然蛋白質(zhì)抑制劑來調(diào)節(jié)，如衍生自單核細(xì)胞增生李斯特菌前體的AcrIIA4。
在質(zhì)粒或病毒表達(dá)構(gòu)建體中，通過Cas9/gRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物將CRISPR核酸酶遞送到宿主細(xì)胞中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。據(jù)報(bào)道，除了與轉(zhuǎn)染DNA或病毒構(gòu)建體相關(guān)的細(xì)胞毒性降低，易于調(diào)節(jié)核酸酶劑量以及節(jié)省載體生產(chǎn)時(shí)間外，使用RNP能減少OTE，因?yàn)槠渚哂锌焖俎D(zhuǎn)換率。而當(dāng)使用Cas9 mRNA時(shí)，也報(bào)道了降低的OTE。
然而，使用RNP也可以觸發(fā)某些細(xì)胞中的先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致CRISPR實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞毒性增加，使用化學(xué)修飾或磷酸酶處理的gRNA可以幫助減輕這些反應(yīng)并增加細(xì)胞活力。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中控制OTE的策略（圖片來源：Journal of Biotechnology）
盡管可以采取措施減少OTE，但現(xiàn)有技術(shù)可能無法避免。出于這個(gè)原因，研究者不妨在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中采取措施來控制這些效應(yīng)，以增加對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的信心。
結(jié)語
目前，CRISPR基因組編輯技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)超越了實(shí)驗(yàn)室，并且正在被開發(fā)為有望應(yīng)用于多種適應(yīng)癥的治療手段。OTE仍然是牽動(dòng)CRISPR基因組編輯的臨床應(yīng)用的主要問題。全基因組測(cè)序結(jié)合傳統(tǒng)的安全性評(píng)估可能是評(píng)估每種治療劑安全性的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管如此，預(yù)先確定如何避免OTE的策略將有助于降低開發(fā)成本以及提高基于CRISPR的療法開發(fā)的成功率。
上述的體外小化OTE的策略也可以應(yīng)用于體內(nèi)CRISPR基因組編輯。據(jù)報(bào)道，CRISPR/Cas9基因組編輯后的OTE水平遠(yuǎn)低于在細(xì)胞系中觀察到的水平，并且在大多數(shù)情況下，當(dāng)使用當(dāng)前優(yōu)化的檢測(cè)技術(shù)時(shí)，在測(cè)試的動(dòng)物中沒有檢測(cè)到OTE的證據(jù)。
但總是存在引入OTE的機(jī)會(huì)，并且隨著CRISPR/Cas9在治療用途中的應(yīng)用，任何OTE都可能對(duì)患者產(chǎn)生有害影響。隨著該技術(shù)更接近于臨床環(huán)境，我們需要有更穩(wěn)健、靈敏和有效的方法來確認(rèn)OTE是否存在，以進(jìn)一步增強(qiáng)其應(yīng)用的可信度。
參考出處：
doi: 10.1016/j.jbiotec.2018.08.007
doi: 10.1093/nar/gkw1013
13916499749
