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基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被《科學(xué)》雜志列為2013年年度科技進(jìn)展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列的簡稱，Cas是CRISPR相關(guān)蛋白的簡稱。CRISPR/Cas初是在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統(tǒng)。
即將過去的7月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發(fā)現(xiàn)呢？小編梳理了一下這個月生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。
1.Science：治療鐮狀細(xì)胞疾病有戲！抑制蛋白激酶HRI可提高紅細(xì)胞中的胎兒血紅蛋白水平
doi:10.1126/science.aao0932
在一項(xiàng)新的研究中，來自美國費(fèi)城兒童醫(yī)院、賓夕法尼亞大學(xué)和賓夕法尼亞州立大學(xué)的研究人員鑒定出一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞中的血紅蛋白產(chǎn)生的關(guān)鍵蛋白，從而為在未來開發(fā)出治療鐮狀細(xì)胞疾病（sickle cell disease, SCD）的創(chuàng)新性藥物提供了一種潛在的靶標(biāo)。在體外培 養(yǎng)的人體細(xì)胞中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明阻斷這種蛋白能夠降低讓紅細(xì)胞形狀扭曲的特征性鐮刀形狀。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年7月20日的Science期刊上，論文標(biāo)題為“Domain-focused CRISPR screen identifies HRI as a fetal hemoglobin regulator in human erythroid cells”。論文通信作者為費(fèi)城兒童醫(yī)院的Gerd A. Blobel博士和賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的Junwei Shi博士。
圖片來自Wikipedia/Illustration from Anatomy & Physiology。
導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞疾病的突變存在于成人形式的血紅蛋白中，這就是這種疾病僅影響出生后的患者的原因。這種突變導(dǎo)致細(xì)胞呈現(xiàn)出異常的新月形狀，阻塞血管和損害器官，從而造成痛苦的有時甚至是危及生命的結(jié)果。血液學(xué)家早就知道相比于成人血紅蛋白，具有較高比例 的胎兒血紅蛋白的鐮狀細(xì)胞疾病患者具有較輕的癥狀。增加胎兒血紅蛋白比例的藥物羥基脲是當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但它并不適用于所有患者。因此，在這項(xiàng)新的研究中，這些研究人員尋求一種改進(jìn)的療法。
Blobel和Shi依靠一種使用CRISPR基因編輯技術(shù)的篩選工具。Shi之前開發(fā)出這種工具來研究基因的特定功能性結(jié)構(gòu)域，而不會干擾整個基因的功能。在這種特定的篩選中，這些研究人員著重關(guān)注一類包含蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域，這些蛋白激酶潛在地可通過小分子加以抑制。 這種篩選使得這些研究人員發(fā)現(xiàn)HRI是一種有助于抑制成人紅細(xì)胞中胎兒血紅蛋白產(chǎn)生的激酶。此外，通過鑒定出一種受到HRI調(diào)節(jié)的已知抑制胎兒血紅蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，他們的研究有助認(rèn)識HRI如何抑制胎兒血紅蛋白產(chǎn)生。當(dāng)他們選擇性地移除HRI的功能時，他們提高了 紅細(xì)胞中的胎兒血紅蛋白水平。
在這些概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，Blobel和Shi進(jìn)一步研究了當(dāng)與其他的旨在提高胎兒血紅蛋白產(chǎn)生的藥物聯(lián)合使用時，一種抑制HRI的候選藥物是否可能是更加有效的。這些研究人員將HRI移除與泊馬度胺（pomalidomide）處理聯(lián)合使用，其中已知泊馬度胺是一種增加胎兒血紅蛋 白產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)性藥物。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，聯(lián)合使用HRI移除和泊馬度胺要比單獨(dú)使用HRI移除或泊馬度胺具有更強(qiáng)的效果，這就支持對鐮狀細(xì)胞疾病進(jìn)行聯(lián)合治療的想法。
2.Cell：利用CRISPRi技術(shù)繪制人細(xì)胞中的基因相互作用圖譜
doi:10.1016/j.cell.2018.06.010
在一項(xiàng)新的研究中，來自美國加州大學(xué)舊金山分校的研究人員使用一種基于CRISPR的高通量技術(shù)快速地繪制人細(xì)胞中將近500個基因的功能圖譜，其中的許多基因之前從未被詳細(xì)地研究過。相關(guān)研究結(jié)果于2018年7月19日在線發(fā)表在Cell期刊上，論文標(biāo)題為“Mapping the Genetic Landscape of Human Cells”。
這項(xiàng)研究產(chǎn)生了大量新的遺傳數(shù)據(jù)，包括鑒定出參與細(xì)胞能量產(chǎn)生的新基因，并解釋了為何一些膽固醇藥物可用于治療骨質(zhì)疏松癥而相關(guān)藥物沒有這種效果的長期謎團(tuán)。但是，這些研究人員說，一個為重要的研究結(jié)果就是這項(xiàng)研究展示了一個用于繪制人細(xì)胞中基因功能的新框架，而且他們希望這終擴(kuò)展到整個人類基因組。
在這項(xiàng)新研究中，Horlbeck及其同事門對之前的實(shí)驗(yàn)中揭示的與細(xì)胞生長和存活相關(guān)的472個基因進(jìn)行了基因相互作用圖譜分析。為此，他們使用了一種被稱作CRISPR抑制（CRISPR inhibition, CRISPRi）的工具。CRISPRi是CRISPR基因編輯系統(tǒng)的一個改進(jìn)版本，能夠在不編輯DNA本身的情況下降低基因活性。CRISPRi是Weissman實(shí)驗(yàn)室在2013年開發(fā)出來用于哺乳動物細(xì)胞中的，而且2016年，Weissman實(shí)驗(yàn)室利用它破解非編碼RNA分子的功能（Science, doi:10.1126/science.aah7111）。
這些研究人員利用CRISPRi系統(tǒng)性地讓兩種不同白血病細(xì)胞系中的成對基因---一種細(xì)胞系代表急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）和另一種細(xì)胞系代表慢性髓性白血病（CML）---滅活，同時測量對細(xì)胞生長的影響。由此產(chǎn)生的111628個*的雙基因相互作用圖譜允許這些研究人員根據(jù)它們彼此之間的關(guān)系將472個基因分為不同的基因簇，并為這些基因簇分配功能意義，比如特定的生物通路或在細(xì)胞內(nèi)的位置。
3.兩篇Cell發(fā)現(xiàn)噬菌體抱團(tuán)抑制細(xì)菌CRISPR免疫系統(tǒng)，有助改進(jìn)噬菌體療法
doi:10.1016/j.cell.2018.06.013; doi:10.1016/j.cell.2018.05.058
CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的簡稱。它是旨在抵御外來DNA的細(xì)菌免疫系統(tǒng)的一個重要的組成部分。在細(xì)菌中，CRISPR的作用就像在人體細(xì)胞中的一把剪刀一樣，切割外來的DNA鏈。盡管科學(xué)家們已知道CRISPR在野外大約一半的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)到，但他們對CRISPR與入侵的病毒或噬菌體之間的分子戰(zhàn)爭知之甚少。
圖片來自Mulepati, S., Bailey, S.; Astrojan/Wikipedia/ CC BY 3.0。
在2018年7月19日同時在線發(fā)表在Cell期刊上的兩篇論文中，來自兩個研究團(tuán)隊(duì)的研究人員提供了當(dāng)入侵含有CRISPR的細(xì)菌時，噬菌體彼此間進(jìn)行合作的證據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)為了壓制CRISPR的破壞，噬菌體通過聯(lián)合起來快速地感染細(xì)菌來加以適應(yīng)，而且有時一個噬菌體還會為此作為引火噬菌體（primer phage）犧牲自我。這兩個研究團(tuán)隊(duì)---來自美國加州大學(xué)舊金山分校和英格蘭埃克塞特大學(xué)----著重關(guān)注細(xì)菌和噬菌體之間基于CRISPR和抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR protein）的免疫關(guān)系。這兩篇論文的標(biāo)題為“Bacteriophage Cooperation Suppresses CRISPR-Cas3 and Cas9 Immunity”和“Anti-CRISPR Phages Cooperate to Overcome CRISPR-Cas Immunity”。
4.Nat Biotechnol：厄運(yùn)不斷，CRISPR/Cas9基因編輯竟導(dǎo)致大片段DNA缺失和重排
doi:10.1038/nbt.4192
根據(jù)一項(xiàng)新的研究，CRISPR基因編輯工具能夠?qū)е禄蚪M上的靶位點(diǎn)附近發(fā)生大片段DNA缺失和重排。這些變化能夠干擾對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋，并且可能使得設(shè)計(jì)基于CRISPR的療法的努力復(fù)雜化。相關(guān)研究結(jié)果于2018年7月17日在線發(fā)表在Nature Biotechnology期刊上，論文標(biāo)題為“Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements”。
人們經(jīng)常利用CRISPR產(chǎn)生小片段DNA缺失，希望這樣能夠破壞一個基因的功能。但是在檢查CRISPR編輯時，Bradley和他的同事們發(fā)現(xiàn)了大片段DNA---通常長數(shù)千個堿基---的缺失和復(fù)雜的DNA序列重排，這些重排導(dǎo)致之前相隔遙遠(yuǎn)的DNA序列被拼接在一起。這種現(xiàn)象在他們測試的所有三種細(xì)胞類型---小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠造血祖細(xì)胞和一種人分化細(xì)胞系---中都很普遍。
5.Mol Cell：揭示CRISPR/Cas9基因編輯為何有時會遭遇失敗
doi:10.1016/j.molcel.2018.06.005
在一項(xiàng)新的研究中，來自美國伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校的研究人員描述了為什么CRISPR基因編輯有時無法發(fā)揮作用，以及如何讓它更加地發(fā)揮作用。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年7月5日的Molecular Cell期刊上，論文標(biāo)題為“Enhanced Bacterial Immunity and Mammalian Genome Editing via RNA-Polymerase-Mediated Dislodging of Cas9 from Double-Strand DNA Breaks”。
在這項(xiàng)新的研究中，這些研究人員證實(shí)當(dāng)利用CRISPR進(jìn)行基因編輯遭遇失敗（大約在15％的時間發(fā)生）時，這通常是由于Cas9蛋白持續(xù)地結(jié)合到DNA上，這會阻止DNA修復(fù)酶進(jìn)入切割位點(diǎn)。
進(jìn)一步的研究表明引導(dǎo)Cas9僅結(jié)合到DNA雙鏈中的一條鏈會促進(jìn)Cas9與RNA聚合酶之間的相互作用，從而有助于將無法發(fā)揮作用的Cas9轉(zhuǎn)化為一種的基因組編輯器。具體而言，他們發(fā)現(xiàn)在基因組編輯過程中，Cas9對DNA鏈的選擇保持一致性會迫使RNA聚合酶與Cas9碰撞，從而將Cas9從DNA上撞下來。
這些研究發(fā)現(xiàn)是非常重要的，這是因?yàn)樵诨蚪M編輯過程中，Cas9和DNA鏈之間的相互作用已知是一個“限速步驟”。這意味著它是這個基因組編輯過程中慢的部分；因此，這個步驟發(fā)生的變化有可能影響基因組編輯的總體持續(xù)時間。
6.Nature：利用CRISPR改善化療藥物甲氨蝶呤的抗癌療效
doi:10.1038/s41586-018-0316-7
作為一種經(jīng)典的化療藥物，甲氨蝶呤（methotrexate）已在臨床上使用了將近70年。它的基本作用機(jī)制是*的。這種藥物抑制二氫葉酸還原酶（DHFR），其中DHFR是一種產(chǎn)生被稱作四氫葉酸（THF）的葉酸功能形式的酶。THF是制備核酸---比如攜帶細(xì)胞遺傳信息的DNA和參與蛋白表達(dá)的RNA---所需的原料所*的。細(xì)胞增殖必須復(fù)制它們的DNA，因此它們需要大量的THF，而且即便不發(fā)生分裂的細(xì)胞需要產(chǎn)生RNA，它們也需要THF。
圖片來自Lisa Nip/Whitehead Institute。
甲氨蝶呤經(jīng)常被用來治療一種被稱作急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）的兒童白血病，而且當(dāng)作為一種多層面治療計(jì)劃的一部分時，它是高度有效的。但是這是有代價的。鑒于甲氨蝶呤不僅會損害癌細(xì)胞，而且也會損害健康組織，因此必須非常小心地使用它。對接受高劑量甲氨蝶呤治療（這是針對ALL的一種主流的治療方法）的兒童患者來說，這可能意味著需要在醫(yī)院度過幾天以便接受嚴(yán)格的臨床監(jiān)測。
在一項(xiàng)新的研究中，來自美國麻省理工學(xué)院懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所的David Sabatini、Sabatini實(shí)驗(yàn)室博士后研究員Naama Kanarek及其同事們開創(chuàng)性地利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)篩選參與甲氨蝶呤敏感性的因素。他們?nèi)〉玫囊唤M令人吃驚的發(fā)現(xiàn)指出組氨酸降解是癌細(xì)胞對甲氨蝶呤敏感的一種重要的決定因素。這一發(fā)現(xiàn)不僅有助于闡明甲氨蝶呤的生物學(xué)特性，而且也提示著一種簡單的膳食補(bǔ)充劑可能有助于擴(kuò)大它的治療窗口和降低它的毒性。相關(guān)研究結(jié)果于2018年7月11日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Histidine catabolism is a major determinant of methotrexate sensitivity”。
如今，Kanarek開展的CRISPR/Cas9篩選結(jié)果進(jìn)一步有助于闡明甲氨蝶呤的分子機(jī)制。她和她的同事們發(fā)現(xiàn)另一種被稱作FTCD的酶也參與組氨酸降解。令人關(guān)注的是，F(xiàn)TCD也需要THF發(fā)揮它的功能，不過不同于作為甲氨蝶呤的主要靶標(biāo)的DHFR的是，F(xiàn)TCD并不是甲氨蝶呤的主要靶標(biāo)。盡管這兩種酶對THF存在著不同的需求，但是它們都從相同的THF庫中獲取它。
在正常情形下，這個THF庫是非常充足的，因此這兩種酶不會競爭THF資源，即便是在快速分裂的細(xì)胞中，也是如此。但是當(dāng)THF的數(shù)量有限---就像接受甲氨蝶呤治療的細(xì)胞中的那樣---時，情況就*不同了。就這種情形而言，F(xiàn)TCD的活性就存在嚴(yán)重的問題，這是因?yàn)門HF庫中沒有足夠的THF來支持細(xì)胞增殖和組氨酸降解。當(dāng)這種情形發(fā)生時，細(xì)胞就會死亡。
7.Science子刊：重大進(jìn)展！利用叛變的癌細(xì)胞清除原發(fā)性癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥
doi:10.1126/scitranslmed.aao3240
假使癌細(xì)胞經(jīng)重編程后能夠抵抗它們自己的同類將會怎么樣？在一項(xiàng)新的研究中，來自美國布萊根婦女醫(yī)院和麻省總醫(yī)院的研究人員憑借基因編輯的力量使得利用癌細(xì)胞殺死癌癥取得關(guān)鍵性的進(jìn)展。他們在多種癌細(xì)胞類型的臨床前模型中報道了有希望的結(jié)果，這就為治療原發(fā)性癌癥、復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥建立了潛在的臨床轉(zhuǎn)化路線圖。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年7月11日的Science Translational Medicine期刊上，論文標(biāo)題為“CRISPR-enhanced engineering of therapy-sensitive cancer cells for self-targeting of primary and metastatic tumors”。
這些研究人員開發(fā)出并測試了兩種利用癌細(xì)胞的這種自我歸巢能力的技術(shù)。種技術(shù)是一種“現(xiàn)成的”技術(shù)，它對治療抵抗性的癌細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使得它們能夠分泌死亡受體靶向配體（death receptor–targeting ligand），這就使得它們與患者的HLA表型（本質(zhì)上指的是人體的免疫指紋）相匹配，從而用于原發(fā)性癌癥臨床前模型中。第二種技術(shù)是一種“自體”方法，它利用CRISPR技術(shù)對來自患者的治療敏感性癌細(xì)胞進(jìn)行基因改造，從而敲除治療特異性的細(xì)胞表面受體，隨后再次對它們進(jìn)行基因改造，使得它們表達(dá)受體自我靶向配體（receptor self-targeted ligand），從而用于復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥的自體模型中。
為了測試這兩種方法，這些研究人員使用了原發(fā)性腦癌、復(fù)發(fā)性腦癌和已擴(kuò)散到大腦中的乳腺癌的小鼠模型。他們觀察到這些經(jīng)過基因改造的癌細(xì)胞直接遷移到腫瘤部位，并發(fā)現(xiàn)了這些癌細(xì)胞特異性地靶向并殺死小鼠體內(nèi)的復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥的證據(jù)。他們報道這種治療可提高這些小鼠的存活率。此外，他們還給這些經(jīng)過基因改造的癌細(xì)胞配備上一個“殺死開關(guān)（kill switch）”。這個殺死開關(guān)在治療后能夠被激活，而且PET成像表明這個殺傷開關(guān)的作用清除這些經(jīng)過基因改造的癌細(xì)胞。
8.重大進(jìn)展！在哺乳動物中測試充滿爭議性的CRISPR基因驅(qū)動技術(shù)
doi:10.1101/362558
一種有爭議的能夠改變整個物種基因組的技術(shù)已應(yīng)用于哺乳動物中。在一項(xiàng)于2018年7月4日發(fā)表在bioRxiv預(yù)印本服務(wù)器上的研究中，來自美國加州大學(xué)圣地亞哥分校研究人員描述了利用CRISPR基因編輯在實(shí)驗(yàn)室小鼠中開發(fā)可能*有問題的動物群體的“基因驅(qū)動（gene drive）” 技術(shù)。
基因驅(qū)動確保將經(jīng)過選擇的突變傳遞給動物的幾乎所有后代。作為一種潛在的瘧疾控制策略，科學(xué)家們已在實(shí)驗(yàn)室中構(gòu)建出針對蚊子的基因驅(qū)動。人們已提出了這種技術(shù)有助于殺死入侵的大鼠、小鼠和其他的嚙齒類動物害蟲的可能性。這項(xiàng)新的研究澆滅了這種情形很快就會發(fā)生的希望。這種技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室小鼠中發(fā)揮的作用缺乏一致性，而且在人們考慮在野外使用這種工具之前，無數(shù)的技術(shù)障礙仍然存在著。
基因驅(qū)動的作用機(jī)制是確保更高比例的有機(jī)體后代確定性地而不是偶然地遺傳某種“自私”基因，從而允許突變或外源基因在群體中快速地傳播。它天然存在于包括小鼠在內(nèi)的某些動物體內(nèi)，這會導(dǎo)致它們死亡或不育。但是CRISPR-Cas9基因編輯工具已導(dǎo)致人們開發(fā)出合成基因驅(qū)動，比如這種合成基因驅(qū)動通過確保后代是不育的來清除野外的傳播瘧疾的蚊子等有問題的物種。
在這項(xiàng)新的研究中，由加利福尼亞大學(xué)圣地亞哥分校發(fā)育遺傳學(xué)家Kim Cooper領(lǐng)導(dǎo)的一個研究團(tuán)隊(duì)并沒有嘗試開發(fā)讓實(shí)驗(yàn)室小鼠（Mus musculus）不育的基因驅(qū)動。相反，Cooper團(tuán)隊(duì)的目標(biāo)是為這種技術(shù)創(chuàng)建一個也可能對基礎(chǔ)研究有用的測試平臺：它使得小鼠偏好遺傳一種導(dǎo)致它們產(chǎn)生白色毛發(fā)的突變。
基于CRISPR的基因驅(qū)動利用這種基因編輯工具將一條染色體上的突變復(fù)制到與這條染色體配對的第二條染色體上，這通常是在動物的早期發(fā)育期間開展的。當(dāng)Cooper團(tuán)隊(duì)在小鼠胚胎中嘗試這種方法時，這種突變并不總是被正確地復(fù)制，并且這種方法僅適用于雌性小鼠的胚胎。
Cooper團(tuán)隊(duì)估計(jì)，平均而言，這可能導(dǎo)致一種突變傳播到大約73％的雌性小鼠的后代，而不是大多數(shù)基因依據(jù)正常的遺傳規(guī)則有50%的幾率遺傳給后代。Cooper拒絕針對她的團(tuán)隊(duì)的研究工作發(fā)表評論，這是因?yàn)樗駷橹共⑽丛谕性u審的期刊上發(fā)表。
9.Nature：重大突破！無需病毒載體，利用電穿孔成功對人T細(xì)胞進(jìn)行CRISPR基因編輯
doi:10.1038/s41586-018-0326-5
在一項(xiàng)新的研究中，來自美國加州大學(xué)舊金山分校的研究人員在不使用病毒插入DNA的情形下對人T細(xì)胞（一種免疫細(xì)胞）進(jìn)行重編程。這一成就對研究、醫(yī)學(xué)和產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生重大的影響。他們期待他們的方法---一種快速的通用的經(jīng)濟(jì)的采用CRISPR基因編輯技術(shù)的方法---將會在新興的細(xì)胞治療領(lǐng)域中得到廣泛使用，加速開發(fā)出新的更加安全的治療癌癥、自身免疫疾病和其他疾病（包括罕見的遺傳性疾病）的療法。相關(guān)研究結(jié)果于2018年7月11日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting”。
圖片來自Meletios Verras/iStock。
這種新方法提供了一種強(qiáng)大的分子“剪切和粘貼”系統(tǒng)，用于重寫人T細(xì)胞中的基因組序列。它依賴于電穿孔，即一種將電場施加到細(xì)胞上使得它們的細(xì)胞膜暫時地更具有滲透性。在一年內(nèi)試驗(yàn)了數(shù)千個變量之后，這些研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某些數(shù)量的T細(xì)胞、DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起然后暴露在一種適當(dāng)?shù)碾妶鲋袝r，這些T細(xì)胞將攝入DNA和CRISPR剪刀，并且地將特定的基因序列整合到CRISPR在基因組中的靶切割位點(diǎn)上。
論文通信作者、加州大學(xué)舊金山分校微生物學(xué)與免疫學(xué)副教授Alex Marson博士說，“這是一種快速而又靈活的方法，可用于改變、強(qiáng)化和重編程T細(xì)胞，這樣我們就能夠給它們提供我們想要的特異性來清除癌癥、識別感染或者抑制自身免疫性疾病中觀察到的過度免疫反應(yīng)。”
10.Science：從結(jié)構(gòu)上揭示I型CRISPR-Cas系統(tǒng)降解靶DNA機(jī)制
doi:10.1126/science.aat0839
作為流行的CRISPR 系統(tǒng)，I型CRISPR-Cas的特征是有序的靶標(biāo)搜索和降解。首先，多亞基監(jiān)測復(fù)合物Cascade（用于抗病毒防御的CRISPR相關(guān)復(fù)合物）識別相匹配的兩側(cè)具有前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer-adjacent motif, PAM）的雙鏈DNA靶標(biāo)，促進(jìn)CRISPR RNA（crRNA）和靶DNA鏈之間形成異源雙鏈體，并將非靶DNA鏈置換掉，從而導(dǎo)致在靶位點(diǎn)上形成R-環(huán)（R-loop）。隨后，將具有解螺旋酶活性和核酸酶活性的酶Cas3特異性地招募到Cascade/R-loop上并切割和漸進(jìn)性地降解靶DNA鏈。來自褐色嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca, Tfu）的I-E型Cascade/R-loop和Cas3/單鏈DNA（ssDNA）復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)闡明了PAM識別和R-環(huán)形成機(jī)制。然而，Cas3招募、DNA切割和降解機(jī)制仍然是難以捉摸的。
在一項(xiàng)新的研究中，來自美國康奈爾大學(xué)和哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員重建出TfuCascade/R-loop/Cas3（即來自褐色嗜熱裂孢菌的Cascade/R-loop/Cas3）三元復(fù)合物，并利用單顆粒低溫電鏡技術(shù)（cryo-EM）解析出它在R-環(huán)切割前狀態(tài)和R-環(huán)切割后狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果 為理解I型CRISPR-Cas系統(tǒng)中crRNA指導(dǎo)的DNA降解提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年7月6日的Science期刊上，論文標(biāo)題為“Structure basis for RNA-guided DNA degradation by Cascade and Cas3”。
這些研究人員解析出TfuCascade/R-loop/Cas3在非靶DNA鏈切割前狀態(tài)下的分辨率為3.7埃的低溫電鏡圖。Cas3的結(jié)合不會引起形成R-環(huán)的Cascade復(fù)合物發(fā)生進(jìn)一步構(gòu)象變化，這提示著Cascade-Cas3相互作用在很大程度上是一種構(gòu)象捕獲機(jī)制而不是一種誘導(dǎo)契合機(jī)制。 Cas3-Cascade相互作用*是由Cascade中的Cse1亞基介導(dǎo)的。Cas3對Cascade的識別是由于與Cascade/R-loop在電荷和表面輪廓上是互補(bǔ)的，但與Cascade的種泡狀態(tài)（seed-bubble state）并不是互補(bǔ)的。這是因?yàn)樵赗-環(huán)充分形成之前，Cse1的C-末端結(jié)構(gòu)域處于一種替 代性方向。通過與Cse1的兩個結(jié)構(gòu)域進(jìn)行廣泛接觸，Cas3能夠檢測Cse1的表面輪廓發(fā)生變化，從而排斥處于這樣的功能狀態(tài)下的Cascade。有條件地將Cas3招募到Cascade上就能夠避免錯誤靶向僅具有部分互補(bǔ)性的DNA。
再者，這些研究人員提供了直接的證據(jù)表明一種底物移交機(jī)制對I-E型CRISPR干擾是至關(guān)重要的。Cas3的HD核酸酶結(jié)構(gòu)域直接捕獲非靶DNA鏈用于鏈切割，而且這種作用*繞過了它的解旋酶結(jié)構(gòu)域。這種底物捕獲依賴于非靶DNA鏈中存在的柔性凸起，而且這種切割位點(diǎn)偏 好性是由這種招募通路預(yù)先確定的。
這些研究人員進(jìn)一步解析出TfuCascade/R-loop/Cas3在非靶DNA鏈切割后狀態(tài)下的分辨率為4.7埃的結(jié)構(gòu)，這就允許他們鑒定出與這種鏈切割反應(yīng)相伴隨的結(jié)構(gòu)變化。這種結(jié)構(gòu)揭示出由于增加的柔性，R環(huán)區(qū)域中的完整非靶DNA鏈消失了。一旦腺苷5'-三磷酸（ATP）水解， 與PAM相鄰的一半非靶DNA鏈自發(fā)地重新定位到Cas3中的解旋酶結(jié)構(gòu)域的開口處。因此，在ATP水解時，Cas3的解旋酶結(jié)構(gòu)域讓非靶DNA鏈通過它自身并進(jìn)一步進(jìn)入Cas3的HD核酸酶結(jié)構(gòu)域，從而進(jìn)入一種漸進(jìn)性DNA降解模式。
11.Nat Commun：科學(xué)家成功將皮膚細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞
doi:10.1038/s41467-018-05067-x
我們的體內(nèi)含有多種類型的細(xì)胞，每一種細(xì)胞都扮演著不同的類型的角色，2012年諾貝爾獲獎?wù)?mdash;日本科學(xué)家山中伸彌通過研究將成體皮膚細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化成了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（ipsC），這一過程稱之為重編程作用。
截止到目前為止，重編程過程僅可能引入關(guān)鍵的基因促進(jìn)細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)化，這種基因稱之為“山中因子”（Yamanaka factors），其能被被人工轉(zhuǎn)入到正常情況下并不具有活性的皮膚細(xì)胞中；近日，來自芬蘭赫爾辛基大學(xué)等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們通過激活細(xì)胞自身的基因，成功將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了多能干細(xì)胞，相關(guān)研究刊登于雜志Nature Communications上，文章中，研究人員利用基因編輯工具CRISPRa直接對細(xì)胞中相關(guān)的基因進(jìn)行了激活，他們利用了一種“鈍化”版本的Cas9剪刀，其并不會對DNA進(jìn)行切割，而是能在不對基因組進(jìn)行突變的基礎(chǔ)上來激活基因的表達(dá)。
研究者Otonkoski教授表示，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)能用來激活基因的表達(dá)，其在細(xì)胞重編程上能表現(xiàn)出巨大的潛力，因?yàn)槠湓谕粫r間里能對多個基因進(jìn)行靶向作用，相比對轉(zhuǎn)基因進(jìn)行過表達(dá)作用，基于激活內(nèi)源性基因的重編程過程從理論上來講能夠以一種生理學(xué)的方式來控制細(xì)胞的命運(yùn)，同時還能產(chǎn)生較多正常的細(xì)胞；文章中，研究人員對CRISPR激活系統(tǒng)進(jìn)行了工程化修飾，使其能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行強(qiáng)大的重編程作用以產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
12.兩項(xiàng)研究表明利用CRISPR-Cas9基因組編輯有望治療α-1抗胰蛋白酶缺乏癥
doi:10.1089/hum.2017.225; doi:10.1089/hum.2017.227
在兩項(xiàng)開創(chuàng)性的概念驗(yàn)證研究中，兩個研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)校正導(dǎo)致α-1抗胰蛋白酶（alpha-1 antitrypsin, AAT）缺乏癥的基因突變，成功地在α-1抗胰蛋白酶缺乏癥（AATD）模式小鼠的肝臟中進(jìn)行靶向基因校正，將低水平的正常AAT恢復(fù)到正常水平。
在項(xiàng)研究中，來自美國馬薩諸塞大學(xué)、中國同濟(jì)大學(xué)和武漢大學(xué)的研究人員同時注射兩種腺相關(guān)病毒（AAV）載體：一種AAV載體用于運(yùn)送CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的Cas9組分；另一種AAV載體編碼靶向AAT的向?qū)NA（gRNA）并攜帶一種同源依賴性修復(fù)模板。相關(guān)研究結(jié)果于2018年5月14日在線發(fā)表在Human Gene Therapy期刊上，論文標(biāo)題為“In vivo Genome Editing Partially Restores Alpha1-Antitrypsin in a Murine Model of AAT Deficiency”。
圖片來自iStock/Meletios Verras。
在第二項(xiàng)研究中，來自美國Editas醫(yī)藥公司和圣路易斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員證實(shí)了一種基因敲降方法導(dǎo)致肝細(xì)胞中的有毒性的發(fā)生突變的AAT表達(dá)下降了98%以上，并且利用一種雙載體系統(tǒng)在靶突變位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了4％～5％的核苷酸校正。相關(guān)研究結(jié)果于2018年6月22日在線發(fā)表在Human Gene Therapy期刊上，論文標(biāo)題為“Amelioration of Alpha-1 Antitrypsin Deficiency Diseases with Genome Editing in Transgenic Mice”。
13.Mol Cell：封面文章解讀CRISPR-Cas系統(tǒng)蛋白所扮演的關(guān)鍵角色
doi:10.1016/j.molcel.2018.05.002
近日，一項(xiàng)刊登在雜志Molecular Cell上的研究報告中，來自喬治亞州立大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員通過研究深入闡明了深入闡明了基于RNA的病毒免疫系統(tǒng)—CRISPR-Cas的基本生物學(xué)機(jī)制。CRISPR-Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌能用來抵御病毒和其它外來“入侵者”的一種防御機(jī)制，當(dāng)細(xì)菌被病毒攻擊時，其就能將病毒DNA“切碎”并將入侵者的一部分DNA分子片段插入細(xì)菌自身的基因組，并以這種方式來記錄病毒的DNA，隨后細(xì)菌就會利用DNA制造RNAs，并將其同細(xì)菌的蛋白相結(jié)合，殺滅病毒的DNA。
研究者M(jìn)ichael Terns表示，相比研究如何利用CRISPR進(jìn)行治療或醫(yī)學(xué)用途而言，本文研究更多的是一項(xiàng)基礎(chǔ)性的研究成果，這項(xiàng)研究是適應(yīng)性研究過程的特殊一步，即識別出病毒的特殊DNA序列，并將其整合到宿主的基因組中，為后代提供更多的免疫力。此前研究人員并不理解細(xì)胞如何識別病毒為外來入侵者，以及哪些細(xì)菌蛋白對于成功整合和提供免疫力是*的。這項(xiàng)研究中，研究人員通過研究闡明了細(xì)菌的免疫系統(tǒng)如何制造記憶分子來移除有害的病毒DNA序列，同時研究人員還揭示了這種特性是如何傳遞給細(xì)菌后代的。
通過分析相應(yīng)的數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)，此前鑒別出的特征不明顯的Cas4蛋白質(zhì)或許與CRISPR-Cas系統(tǒng)中的Cas1和Cas2蛋白存在于一定的關(guān)聯(lián)，在初的適應(yīng)階段，其中一個Cas4蛋白能夠識別序列中的關(guān)鍵“信號占位符”，而這種序列距離分離的DNA序列較近。當(dāng)Cas1和Cas2、以及其中一個Cas4存在于細(xì)胞中時，其就會扮演基于隊(duì)伍的免疫系統(tǒng)“將軍”的角色，同均一尺寸的切斷DNA序列相互“溝通”，并且決定下一步的方向，給出終摧毀致命DNA分子片段的指令。
細(xì)胞為了成功識別并且去除DNA分子片段，其就會將這些DNA分子片段的信息摻入到自身的基因組中實(shí)現(xiàn)免疫效力，而且Cas4蛋白必須存在于細(xì)胞中并與Cas1和Cas2串聯(lián)起來。研究者Terns說道，Cas4存在于許多CRISPR-Cas系統(tǒng)中，但這些蛋白質(zhì)所扮演的角色研究人員卻并不清楚，在細(xì)菌的免疫系統(tǒng)中，有兩種關(guān)鍵的Cas4蛋白對于控制上述過程非常關(guān)鍵，因此細(xì)菌的功能性RNA需要被制造出來并且被賦予相應(yīng)的免疫力。（生物谷 ）
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